瓊脂糖凝膠中回收基因片段
實(shí)驗(yàn)原理
限制性內(nèi)切酶切割后的DNA*片斷經(jīng)過(guò)電泳后，按分子量大小被分開(kāi)，排列在瓊脂糖凝膠中，可以將特定的某條DNA帶所在的凝膠切下來(lái)，加熱或用特殊的試劑熔解凝膠，使DNA溶回到溶液中，再經(jīng)過(guò)乙醇沉淀或過(guò)柱即可獲得目的 DNA酶切片段。
實(shí)驗(yàn)試劑
1. 電泳緩沖液
2. 熒光染料
3. 電泳級(jí)瓊脂糖粉
4. 10´加樣緩沖液
5. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)
6. DNA凝膠回收試劑盒
實(shí)驗(yàn)設(shè)備
1. 旋渦混合器
2. 微量移液取樣器
3. 移液器吸頭
4. 1.5ml 微量離心管
5. 雙面微量離心管架
6. 臺(tái)式離心機(jī)
7. 瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)
8. 微波爐
9. 恒溫水浴
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 配制TAE電泳緩沖液(10´儲(chǔ)存液)，10´加樣緩沖液，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒(滅菌)、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒(滅菌)。
2. 操作步驟
1) 用1´TAE配制1%瓊脂糖凝膠。DNA用合適的酶切。
2) 在膠上選定兩個(gè)加樣孔，分別加入少量(10μl)和大量(50μl )DNA酶切產(chǎn)物，電泳。
3) 電泳結(jié)束后用刀片切下含有少量DNA酶切產(chǎn)物的泳道(一般選擇位于凝膠的邊緣)，在紫外燈下找到目的DNA 帶，用刀片切在帶的下上下邊緣各切一個(gè)小口作為標(biāo)記。注意：含有大量DNA酶切產(chǎn)物的凝膠既不用加熒光染料，也不用紫外燈照射！
4) 將做好標(biāo)記的凝膠條與未染色的凝膠原位對(duì)齊，根據(jù)小膠條上的標(biāo)記估計(jì)未染色的大膠上DNA酶切產(chǎn)物的位置，用刀片切下大膠中DNA產(chǎn)物所在的凝膠(盡量不要多余的凝膠)，轉(zhuǎn)移至一個(gè)稱量過(guò)的干凈的1.5ml微量離心管中。再稱量后計(jì)算出膠的重量。
5) 按照DNA快速純化/回收試劑盒操作說(shuō)明，純化回收目的片段。
純化/回收試劑盒組成：
溶液A：6M NaClO4，0.03M NaAc，pH5.2，少量酚紅；
溶液B：3M NaAc；
溶液C：用時(shí)加入35ml無(wú)水乙醇；
溶液D：TE緩沖液。
膠回收步驟如下：
a. 將切下的膠帶放入1.5ml離心管中，按照1：3 (膠帶重量：溶液A的體積)的比例加入溶液A；
b. 50℃水溶10min，膠帶*要求*溶化，其間可振蕩助溶2～3次，待溶化后置室溫加入15μl溶液B，充分混勻；
c. 將溶液置于離心柱中，靜置2min，10000rpm離心20s；
d. 倒掉液體，加入500μl溶液C于離心柱中10000rpm離心20s，棄液體，重復(fù)該步驟一次；
e. 12000rpm離心1min，甩干剩余液體以除去殘余乙醇；
f. 將離心柱置于新的離心管中，室溫敞開(kāi)離心管蓋放置5～10min，使乙醇揮發(fā)殆盡；
g. 加入20～30μl溶液D(使用前50℃水浴)，靜置2min；
h. 12000rpm離心1min，管底溶液即為所需DNA，將DNA貯存于-20℃可長(zhǎng)期保存。